Dados do Trabalho

Título

Avaliação do perfil replicativo do vírus SARS-CoV-2 pela amplificação de alvos genômicos e subgenômicos por RT-qPCR

Introdução

O SARS-CoV-2 pertence à família Coronaviridae e é constituído por RNA de polaridade positiva de aproximadamente 30Kb. Durante o ciclo replicativo, o RNA genômico é transcrito em RNA intermediário de polaridade negativa e utilizado como molde para a geração de novas fitas de RNA genômico (gRNA) e RNAs subgenômicos (sgRNA) de polaridade positiva. Os sgRNAs são precursores das proteínas virais de partículas infecciosas e vem sendo indicados como possíveis marcadores da replicação do SARS-CoV-2.

Objetivo (s)

Neste trabalho foi utilizada a técnica de RT-qPCR para avaliar o perfil replicativo do vírus SARS-CoV-2 através da quantificação de diferentes alvos: gRNA, sgRNA e RNA intermediário.

Material e Métodos

Para esse fim, células Vero foram infectadas com vírus SARS-CoV-2 (MOI 0,01) e os sobrenadantes foram coletados 1h, 2h, 3h, 24h e 48h pós-infecção (hpi). Nos ensaios de amplificação por RT-qPCR foram utilizados oligonucleotídeos direcionados ao gRNA dos genes do envelope (ENV) e do nucleocapsídeo (N1/N2), RNA intermediário (ENV-) e sgRNA do envelope (sgRNA E).

Resultados e Conclusão

Os resultados preliminares do gRNA demonstraram que durante as três primeiras horas pós infecção, o SARS-CoV-2 apresentou perfil semelhante nos alvos N1/N2 e ENV, com cerca de 5 Log10 cópias/mL. A partir de 24 hpi, houve um aumento exponencial do título viral, chegando a níveis de 11,64 Log10 cópias/mL no último ponto (48 hpi). O RNA intermediário (ENV -) apresentou um perfil semelhante ao gRNA, atingindo 11,82 Log 10 cópias/mL em 48 hpi. Estes resultados sugerem que a detecção do RNA genômico e RNA intermediário no sobrenadante pode ser resultado da lise celular, liberando material genético viral em diferentes fases do ciclo de replicação, inclusive presente em vesículas de dupla membrana. Em contrapartida, o sgRNA E foi detectado somente a partir de 24 hpi, coincidindo com o aumento exponencial do gRNA. O conjunto de resultados sugere que o sgRNA, precursor de proteínas virais, é um bom marcador para avaliar a replicação ativa do vírus Sars-Cov-2. Estes dados indicam a possibilidade do monitoramento de sgRNA por RT-qPCR como uma alternativa de monitoramento de partículas viáveis de SARS-CoV-2 em processos de desenvolvimento e produção de imunobiológicos. Ensaios adicionais estão sendo realizados utilizando lisados celulares na quantificação por RT-qPCR, bem como, titulação viral por ensaio de placas e microscopia eletrônica, a fim de complementar os dados encontrados neste trabalho.

Palavras-chave

RT-qPCR; sgRNA; SARS-CoV-2;

Agradecimentos

Bio-Manguinhos/Fiocruz