Dados do Trabalho

Título

Caracterização da α-fucosidase de Rhodnius prolixus e sua interação com Trypanosoma cruzi

Introdução

Rhodnius prolixus é um importante vetor do Trypanosoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas. Dentre as diferentes enzimas intestinais de R. prolixus, podemos destacar a α-fucosidase (EC 3.2.1.51) uma glicosídeo hidrolase da família 29 (GH29) responsável pela hidrólise de ligações glicosídicas em fucosídeos e glicoconjugados. Além disso, como parte do ciclo do parasito ocorre no tubo digestório do inseto, e T. cruzi possui uma extensa rede de glicoconjugados de membrana, essa enzima pode estar envolvida na interação parasito-vetor.

Objetivo (s)

Caracterizar α-fucosidase em Rhodnius prolixus e verificar sua interação com Trypanosoma cruzi.

Material e Métodos

Para inibição da expressão gênica utilizamos a técnica de RNAi, onde injetamos dsRNAs para α-fucosidase e GFP (Green Fluorescent Protein) como controle exógeno. O silenciamento foi verificado por qPCR. Nos ensaios enzimáticos usamos 25 µL da amostra com 74 µL de tampão acetato de sódio 0,2M pH4,5 e 1 µL de 4-metilumbeliferil α-L-fucopiranosídeo (No M8527). Fluorescência medida no comprimentos de onda λEx = 355 nm e λEm = 460 nm, a 30◦C por 60 min com leitura cada minuto. A quantidade de proteína foi determinada com Coomassie Blue G. No experimento de adesão o IMP foi cortado longitudinalmente, lavado em PBS e incubado com T. cruzi em agitador vertical por 30 min. A adesão foi observada ao microscópio óptico em GFP e FUC. Para cada tecido foi contado o número de parasitas aderidos em 100 células epiteliais. Para o ensaio de lise a atividade tripanolítica foi verificada no IMAC incubado com tripanossomatídeos das cepas Dm28c. Após incubação a 28°C por 0, 2 e 4h; o número de parasitas foi determinado na câmara de Neubauer.

Resultados e Conclusão

Sangue heparinado foi a escolha com menores efeitos colaterais para o estudo da α-L-fucosidase do intestino médio, quando comparado ao sangue desfibrinado ou citratado. IMAC foi a única fração do intestino médio que induziu α-L-fucosidase. Essa resposta não foi desencadeada pela distensão abdominal ou ingestão de hemácias, e sim pela fração plasmática, ou diferentes estímulos bioquímicos, como ingestão de proteína ou fucoidan, sugerindo que a produção da enzima no IMA é uma resposta fisiológica geral sob controle de diferentes sinais convergentes. O silenciamento por RNAi foi bem-sucedido, resultou em uma queda na atividade em todos os tecidos, uma maior adesão dos parasitos no IMP e um aumento na lise de parasitos em IMAC.

Palavras-chave

α-fucosidase, RNAi, Rhodnius prolixus, Trypanosoma cruzi

Agradecimentos

CAPES