Dados do Trabalho

Título

Ensaios de PCR em tempo real em formato multiplex para identificação dos principais genogrupos de Neisseria meningitidis em amostras clínicas

Introdução

Neisseria meningitidis (Nm) é uma das principais bactérias causadoras de meningite no mundo com altas taxas de morbidade e letalidade. Com a introdução da vacina contra Nm do sorogrupo C no Programa Nacional de Imunização se faz necessário o monitoramento dos sorogrupos de Nm circulantes no país a fim de verificar se há aumento da frequência de outros sorogrupos não contemplados na vacina, ocasionando mudanças no perfil epidemiológico da doença. A identificação molecular dos principais genogrupos de Nm (A, B, C, W, X, Y) em amostras clínicas era realizada com uso de seis ensaios de PCR em tempo real (qPCR) em formato individual, demandando alto custo e tempo de trabalho.

Objetivo (s)

O objetivo do presente projeto foi estabelecer, otimizar e avaliar ensaios de qPCR em formato multiplex para identificação dos genogrupos A, B, C, W, X, Y de Nm, visando redução de custos, de insumos, de amostras e de recursos humanos, resultando em liberação mais rápida dos resultados.

Material e Métodos

Foram estabelecidos dois ensaios de qPCR triplex para identificação dos genogrupos B, C e Y (ensaio BCY) e A, W e X (ensaio AWX). O limite mínimo de detecção (LMD), linearidade, eficiência e reprodutibilidade foram determinados em três diferentes plataformas de qPCR (ABI, Roche e Bio-Rad). Para determinação dos parâmetros de sensibilidade, especificidade e concordância foram utilizadas 240 amostras de DNA extraído de amostras clínicas, sendo empregados os ensaios de qPCR em formato individual como teste comparativo.

Resultados e Conclusão

O LMD dos ensaios BCY e AWX foi de 10 cópias por reação para todos os seis alvos genéticos analisados. A eficiência foi de 81,0% a 114,1% e coeficiente de correlação linear de 0,990 a 0,999 nas três plataformas de qPCR. Os ensaios triplex mostraram-se reprodutíveis no intraensaio com coeficiente de variação (CV) entre 0,24% e 1,52% e no interensaio com CV entre 0,89% e 3,39%. Os ensaios BCY e AWX apresentaram sensibilidade de 95,7%, especificidade de 100%, concordância de 97,5% e índice Kappa de 0,949, indicando concordância muito boa em relação aos ensaios comparativos em formato individual.
Os ensaios de qPCR triplex BCY e AWX apresentaram alta sensibilidade e especificidade para detecção dos principais genogrupos de Nm, representando uma ferramenta importante para caracterização epidemiológica da doença meningocócica.

Palavras-chave

Neisseria meningitidis, reação em cadeia da polimerase em tempo real, infecções meningocócicas, sorogrupo

Agradecimentos

Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo