Dados do Trabalho

Título

Desenvolvimento de estratégia automatizada para isolamento de ácidos nucleicos de Trypanossoma cruzi em amostras clínicas

Introdução

Técnicas moleculares de diagnóstico podem auxiliar na superação, detecção e controle de doenças negligenciadas, como a Doença de Chagas. No entanto, dificuldades são encontradas quanto a padronização dessas metodologias, dessa forma, a automação do processo de extração de DNA pode facilitar a implementação de tais metodologias.

Objetivo (s)

Desenvolver kit automatizado para extração de DNA de T. cruzi utilizando beads magnéticas, em amostras de sangue total.

Material e Métodos

A partir de pesquisa bibliográfica e ensaios de formulação os reagentes e soluções do kit foram determinados. Os testes foram feitos utilizando sangue total canino (certificado CEUA-IB n° 9444180722) e epimastigotas de T. cruzi da linhagem CL Brener. Para validação foi realizada a contaminação (spike) do sangue com epimastigotas de T. cruzi, a diluição variou de 1000 par./ml até 0,1 par./ml de sangue. Após a contaminação, 200 μL de amostra foi pipetado na lise da placa de extração, seguido 20 μL de proteinase K e 5 μL do IAC (controle interno de amplificação do kit NAT Chagas), por fim a placa foi colocada no extrator Extracta 16 (Loccus) e o protocolo iniciado. Após a extração, o kit foi avaliado pelo rendimento e pureza dos ácidos nucleicos a partir de espectrofotometria. A capacidade de amplificação e a detecção dos alvos do parasita foi avaliada por qPCR utilizando o kit NAT Chagas (IBMP).

Resultados e Conclusão

O rendimento médio foi de 44,19 ng/μl de DNA , razão de pureza 260/260 com média 1,81 e 260/230 com média 1,25. A amplificação foi observada para todos os alvos analisados, os CTs médios obtidos foram condizentes até a diluição de 10 par./ml, a partir de 1 par./ml o Ct passou a ficar mais tardio, provavelmente devido a uma restrição do próprio kit de qPCR, que apresenta limite de detecção de até 0,096 par./reação.
O kit foi capaz de extrair de forma rápida o DNA do parasita, a quantidade de ácidos nucleicos recuperados e a razão de pureza 260/280 permite a realização de técnicas moleculares de detecção, que levam a um diagnóstico mais assertivo da doença; a razão de pureza 260/230 ainda deve ser melhorada para realização de NGS, mas não impediu a amplificação dos alvos da reação. Assim sendo, o kit demonstrou ser sensível para recuperação de DNA de T. cruzi até mesmo quando o parasita está presente em quantidades mínimas amostra, o que pode auxiliar no diagnóstico da parasitose tanto na fase aguda quanto na fase crônica.

Palavras-chave

Trypanossoma cruzi, extração de DNA, diagnóstico molecular, beads magnéticas, automatizado

Agradecimentos

Loccus Biotecnologia