Dados do Trabalho

Título

Sequenciamento de Teste Rápido de Antígeno: Otimizações Metodológicas de NGS para Fortalecimento da Vigilância Epidemiológica do SARS-CoV-2 no Estado do Ceará.

Introdução

O aumento da adesão ao diagnóstico da COVID-19 por testes rápidos de antígeno (TR), ocasionou uma diminuição do encaminhamento de amostras para Vigilância Genômica. A presença de compostos biocidas no tampão de amostra faz com que o sequenciamento de TR resulte em variantes virais intra-hospedeiro (minor variants, MV) que prejudicam a qualidade das análises genômicas.

Objetivo (s)

Avaliar a eficácia dos métodos de purificação de bibliotecas genômicas na redução de MV de SARS-CoV-2 no sequenciamento de amostras de TR.

Material e Métodos

Foram utilizadas 28 amostras remanescentes de TR de pacientes residentes de Fortaleza (CE) e região metropolitana. As amostras foram processadas pelo Laboratório Diagnóstico do HEMOCE/UNADIG-CE e triadas no controle de qualidade (ciclo limiar de detecção, CT<25). As soluções de conservação utilizadas foram: (1) 4M isotiocianato de guanidina + 0.2M EDTA, (2) 4M isotiocianato de guanidina + 0.2M citrato de sódio, (3) água livre de nuclease, (4) meio de transporte viral (controle). As bibliotecas passaram por quatro subgrupos de purificação pré-desnaturação: (1) sem purificação (grupo controle), (2) remoção de dsDNA ≥250bp, (3) remoção de dsDNA >700bp e <150bp e (4) remoção de dsDNA >700bp e <200bp. A melhor condição foi avaliada a substituição das beads magnéticas ITB (Illumina Tune Beads) pelas beads ProNex® Chemistry da Promega na purificação final das bibliotecas. O sequenciamento foi realizado pela Rede Genômica da Fiocruz (plataforma Illumina MiSeq, protocolo COVIDSeq).

Resultados e Conclusão

Todos os grupos atingiram os parâmetros de referência mínimos para NGS (COV5x >90x e profundidade >400x), mas as amostras extraídas sem tampão de conservação apresentaram menores valores de MV(x̅=540 ± 258,47). Alternativamente, a purificação com beads ProNex Chemistry resultou em uma diminuição das MV (x̅=326 ± 165,4) e proporcionou maiores valores de cobertura (x̅=98,51 ± 1,52 vs 94,32 ± 1,7).
Os resultados indicam a possibilidade de aprimorar o sequenciamento genômico de amostras de TR, diminuindo a quantidade de mutantes sequenciados. Conclui-se que não é necessário adicionar soluções conservantes. Ainda, as beads ProNex® Chemistry possuem um menor custo e funcionam melhor quando comparadas às beads ITB da Illumina.

Palavras-chave

COVID-19; Purificação de bibliotecas; Sequenciamento genômico; Testes imunocromatográficos.